1.通讯作者及单位：东北亥俄医科大学，张彦桥
2.摘要
转录因子ATF3激活后具有抗炎功能，但是肝脏ATF3在代谢和动脉粥样硬化中的作用未知。这篇文章阐述了ATF3过表达会减少动脉粥样硬化的发展，机制上表明ATF3可以分别与p53和HNF4a相互作用，上调清道夫受体SRB1，下调CYP8B1来增强肝脏对HDL的摄取，并抑制小肠脂肪和胆固醇的吸收，促进巨噬细胞的胆固醇逆向转运。所以说ATF3是调节脂蛋白、胆汁酸代谢以及动脉粥样硬化的关键因子。
3.背景
动脉粥样硬化是冠心病（CHD），中风和外周血管疾病的主要因素，动脉粥样硬化的常见危险因素包括血脂异常、高血压、糖尿病和肥胖。肝脏通过分泌VLDL，摄入HDL、LDL和乳糜微粒来调节脂蛋白稳态，其中最关键的调控因子是清道夫受体SRB1。巨噬细胞RCT通过向肝脏和粪便中运送过量的胆固醇来防止动脉粥样硬化，并且SRB1功能缺失型突变会增加血浆HDL-c和冠心病风险。在肝脏中，游离胆固醇可转化为胆汁酸(BAs)或直接从胆汁中排出。CYP7A1是催化BA合成经典途径的第一步和限速步骤。CYP8B1是胆酸合成的关键酶。BAs合成并分泌到肠道后，95%的BAs被重吸收，这种反馈抑制CYP7A1和CYP8B1的表达，以防止肝脏中BA的过量产生。CYP8B1缺失或过度表达CYP7A1的小鼠对饮食诱导的动脉粥样硬化有抵抗力，这可能是由于诱导胆固醇转化为BAs并减少了胆固醇在肠中的吸收。
ATF3是转录因子ATF/cAMP反应元件结合家族的成员。ATF3与基因启动子中的保守序列TGACGTCA结合，以调节基因表达。ATF3由脂多糖诱导，是巨噬细胞中Toll样受体4信号的负调节因子，从而抑制炎症基因并防止免疫系统过度反应。此外，ATF3被证明在巨噬细胞中介导高密度脂蛋白的抗炎作用。虽然ATF3在炎症中的作用已被很好地理解，但关于肝脏ATF3在调节BA稳态、脂蛋白代谢或动脉粥样硬化中的作用却一无所知。
慢性压力是导致动脉粥样硬化的危险因素，但其潜在机制尚不清楚。慢性压力可能导致血浆LDL-C和甘油三酯水平升高和血小板活化，以及内皮炎症和功能障碍。为了应对急性或慢性压力，下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴被激活以释放皮质醇和其他激素。皮质醇水平升高与CHD发病率增加有关，皮质醇合成的抑制阻止了小鼠动脉粥样硬化的发展。肾上腺功能不全患者的血浆HDL-C水平降低，而用皮质醇(HC)治疗这类患者后，会以剂量依赖的方式增加血浆HDL-C水平。到目前为止，尚不清楚皮质醇如何升高血浆HDL-C水平，以及升高的血浆HDL-C水平是否有助于皮质醇诱导的冠心病。
4.结果
（1）HC通过激活cAMP-PKA通路抑制ATF3的表达
在急性或慢性应激压力下，HPAaxis被激活以促进肾上腺分泌的皮质醇的释放。为了确定哪个应激信号通路影响了ATF3的表达，作者用HC，DEX（地塞米松），A-Ⅱ（血管紧张素Ⅱ）或GCG（胰高血糖素）处理小鼠或人原代肝细胞，发现这些与应激相关的激素或多肽均能显著降低ATF3的水平，其中可以增加胞内cAMP水平的Forskolin（FSK）也降低了ATF3的表达。与此一致的是将db-cAMP处理人/鼠原代肝细胞后，ATF3表达量也下降。这些结果表明应激相关激素可能通过增加cAMP水平来抑制ATF3的表达。接着作者用PKA抑制剂H89和PKI处理细胞后发现阻断了HC对ATF3的抑制作用。
接着作者研究了皮质醇是否影响了体内ATF3的表达，给c57小鼠给予HC后，血浆HDL-C增加了60%，减少了血浆胆汁酸53%。并且HC处理后降低了肝脏ATF3、SRB1、CYP7A1的表达，增加了CYP8B1的表达，且这种作用会被PKA抑制剂H89/PKI所阻断。在肝脏特异性敲除ATF3的小鼠中处理HC后发现，在野生型小鼠中产生的变化在L-ATF3-/-中不存在。这些结果表明，HC调控血浆HDL-C和胆汁酸是需要肝细胞ATF3的。临床样本中也发现自身免疫性肝炎（AIH）或原发性胆管炎患者中ATF3水平降低，且肝脏ATF3水平与血浆HDL-C呈负相关。
（2）肝细胞ATF3调控了血浆HDL-C水平和BA代谢，并且ATF3是肝细胞摄取HDL的重要调控因子。
之后作者在小鼠体内注射AAV8-hATF3过表达的腺相关病*后发现可以降低TC，HDL-C。作者通过RNA-seq系统分析了hATF3调节的基因，发现调节脂蛋白、胆固醇或胆汁酸的基因发生了变化。前面结果也表明ATF3调控SRB1的表达，而SRB1是调节HDLuptake的关键蛋白。将对照小鼠和L-Srb1-/-小鼠原代肝细胞分离后发现，对照组小鼠过表达hATF3后，HDLuptake增加，在L-Srb1-/-小鼠中无变化。ATF3-/-细胞中HDLuptake下降，SRB1表达后回归到正常水平，HepG2中变化也一致。
为了确定ATF3在体内是否也调节了肝细胞对HDL的uptake，作者给小鼠尾静脉注射AAV-hATF3，然后给小鼠静脉注射14C-HDL，结果发现血浆14C-HDL下降，肝脏和粪便中14C-HDL增加。在L-ATF3-/-小鼠中血浆14C-HDL上升，肝脏和粪便中14C-HDL降低。这些结果表明ATF3在调控SRB1介导的肝脏HDL-cuptake过程中起着关键作用。
（3）ATF3通过p53调控了肝脏SR-BI的表达及血浆HDL-C水平。
SR-B1是肝细胞从血浆摄取HDL的关键蛋白，那么ATF3是如何通过SR-B1调节HDL的？P53是肿瘤抑制蛋白，之前研究中表明在肺癌细胞H细胞中它可以与ATF3相互作用，与报道一致的是，ATF3与P53的确存在相互作用，并且在L-P53-/-小鼠中，ATF3过表达并不能降低血浆HDL。在肝脏中，p53fl/fl小鼠中过表达ATF3可以增加SR-B1水平近三倍，而在L-P53-/-小鼠中SR-B1表达减弱。HC处理p53fl/fl小鼠可增加血液HDL，抑制SR-B1的表达，但是在L-P53-/-小鼠中这种变化不存在。
为了了解p53和ATF3是如何协同调节SR-BI的，作者使用一系列截短的SR-BI启动子构建体进行了瞬转。p53或ATF3过表达显著提高SR-BI的启动子活性。当p53结合位点突变时，这种效果消失，接着作者做了电泳迁移率偏移试验(EMSAs)和染色质免疫沉淀(ChIP)来进一步证明。EMSA数据显示，p53蛋白与野生型SR-BI序列的DNA结合，这种结合过量的含有野生型但是不含突变p53结合位点的DNA所取代。ChIP结果说明p53或ATF3与SR-B1近端启动子结合。这些结果都表明了ATF3通过与P53相互作用来调节肝脏SR-B1的表达和血浆HDL-c。
（4）ATF3对小肠脂肪和胆固醇的吸收以及巨噬细胞胆固醇逆向转运（RCT）是必需的。
当ATF3过表达后，抑制胆固醇吸收的TUDC上调了2.6倍，同时之前工作中表明CYP8B1缺失后会抑制小肠脂肪和胆固醇的吸收。基于此，作者猜测ATF3可能调节了小肠对脂肪和胆固醇的重吸收，实验结果发现过表达ATF3后，胆固醇和脂肪重吸收下降。胆固醇逆向转运（RCT）的两个重要途径分别是胆固醇的重新吸收和肝细胞对HDL的摄入，接着作者用同位素追踪的方法检测了RCT途径，结果发现血浆3H-HDL下降，而肝脏和粪便中3H-HDL增加。而在L-ATF3-/-小鼠中血浆3H-HDL增加，肝脏和粪便中3H-HDL下降。这些结果反复验证了ATF3是小肠脂肪和胆固醇吸收以及巨噬细胞RCT的关键调控因子。
（5）ATF3通过ATF3-HNF4a-CYP8B1通路抑制了小肠中脂肪和胆固醇的吸收。
那么ATF3是如何抑制小肠中脂肪和胆固醇的吸收的？上面提到CYP8B1缺失会减少小肠脂肪和胆固醇的吸收，本研究也发现ATF3过表达后显著抑制了CYP8B1的表达，所以CYP8B1可能在ATF3介导的抑制小肠脂肪和胆固醇吸收这一过程中起关键作用。为了验证这一猜想，作者给野生型小鼠过表达ATF3或者CYP8B1，ATF3过表达显著抑制了CYP8B1的表达，在此基础上过表达CYP8B1后又恢复到正常水平，并且阻止了ATF3对CYP7A1的上调，阻止了ATF3对小肠胆固醇和脂肪吸收的抑制作用。
HNF4a是调控ACP7A1和CYP8B1的重要转录因子，本研究中结果发现ATF3过表达引起的ACP8B1的抑制和ACP7A1的上调在HNF4a-/-小鼠中不存在，这表明了HNF4a的重要性。为了确定ATF3和HNF4α如何协同抑制Cyp8b1的表达，作者构建了一系列截短的Cyp8b1启动子构建体并进行瞬转染。数据显示0.1kb至0.kb之间的启动子区对ATF3抑制Cyp8b1表达很重要。HNF4α结合位点的突变消除了ATF3对Cyp8b1启动子活性的抑制作用。HNF4αDN形式也消除了ATF3对Cyp8b1启动子活性的抑制作用。CoIP结果显示ATF3与HNF4α相互作用。ChIP结果显示ATF3与Cyp8b1启动子的近端启动子(0.1-0.kb)结合。这些数据表明ATF3通过与HNF4α的直接相互作用抑制Cyp8b1的表达，ATF3上调CYP7A1的表达是通过LXRa，与FXR无关。这些结果说明了ATF3通过ATF3-HNF4a-CYP8B1来抑制小肠脂肪和胆固醇的吸收，并且ATF3与HNF4a相互作用来抑制CYP8B1的表达，增加LXRa调控的CYP7A1的表达。
（6）ATF3改善动脉粥样硬化，且不依赖于LDLR或ApoE。
之前的结论提示了ATF3可能会阻止动脉粥样硬化的发生，所以作者做了如下实验去验证。ATF3过表达会显著增加肝脏LDLR和APOE的表达，为了确定ATF3过表达是否可以阻止动脉粥样硬化的发生以及LDLR或ApoE是否在这一过程中起作用，作者将西方饮食的ApeE-/-或Ldlr-/-小鼠中过表达了ATF3。在ApeE-/-或Ldlr-/-小鼠肝脏中过表达ATF3后，ATF3，SRB1,CYP7A1和LDLR均上调，CYP8B1下调，且降低了血浆HDL-c，non-HDL-c和TG。并且主动脉斑块及其根部斑块减少。之后作者又在ApoE-/-小鼠中注射PCSK9-DY的AAV病*来有效降低肝细胞LDLR水平，在这种小鼠中注射ATF3后观察到的表型与ApeE-/-或Ldlr-/-小鼠一致，这表明ATF3抑制动脉粥样硬化过程中是不依赖于Apoe和LDLR的。
（7）肝细胞ATF3缺失会加重ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化。
之后，作者用Apoe-/-；Atf3-/-小鼠来研究ATF3缺失在动脉粥样硬化中的作用，将小鼠用WesternDiet喂养3个月后，发现与对照组相比，ATF3，SRB1，CYP7A1蛋白水平下降，CYP8B1增加；血浆HDL-c，non-HDL-c和TG增加，并且主动脉斑块及其根部斑块增加，因此ATF3缺失加速了动脉粥样硬化的发展。
5.创新点及可借鉴之处
（1）肝细胞通过激活cAMP-PKA途径来抑制ATF3的表达，从而加速动脉粥样硬化的发生，解释了动脉粥样硬化的潜在机制。
（2）通过一系列过表达和敲除实验证明了ATF3是血浆HDL-c摄取，小肠脂肪和胆固醇吸收，巨噬细胞胆固醇逆向转运和动脉粥样硬化的关键调节因子。
（3）ATF3通过ATF3-p53-SRB1途径调节血浆HDL摄取，通过ATF3-HNF4a-CYP8B1途径调节小肠脂肪和胆固醇吸收。
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